Ⅳ型鴨肝炎病毒雞胚化弱毒疫苗的研制

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Ⅳ型鴨肝炎病毒雞胚化弱毒疫苗的研制
鄭獻進1 ,2  , 張大丙1  , 曲豐發1 ,3  , 丁春宇1 ,4
(1. 中國農業大學動物醫學院 農業部預防獸醫學重點開放實驗室 , 北京 海淀 100094 ;
2. 大成萬達(天津) 有限公司 , 天津 西青 300380 ; 3. 中國質量認證中心 ,北京 豐臺 100070 ;
4. 西班牙海博萊北京辦事處 ,北京 海淀 100086)
摘要: 將一株 Ⅳ型鴨肝炎病毒(D HV) 用雞胚傳代 ,培育出 Ⅳ型鴨肝炎病毒 63 代雞胚化弱毒疫苗株 E63 。該苗對 1 日齡
雛鴨安全無致病性 ,免疫劑量為 2. 5 ×105. 12 個 ELD50 / 只。用 E63 免疫 1 日齡雛鴨 ,7 日齡時即可產生高峰期中和抗體 ,并可
完全保護雛鴨抵抗同型強毒的攻擊 ,此后中和抗體效價有所下降 ,但可持續至 4 周齡。疫苗在 -  20 ℃保存 3～6 個月后仍能保
持良好的免疫原性。
關鍵詞: 鴨肝炎病毒;  Ⅳ型; 弱毒疫苗
中圖分類號:S859. 79 　　　　文獻標識碼:A 　　　　文章編號:052926005 (2007) 1220006202
Development of a chicken2embryo2adapted attenuated vaccine
of  duck hepatitis type
Ⅳvirus
ZH EN G Xian2jin , ZHAN G Da2bing , QU  Feng2fa , DIN G Chun2yu
( Key Laboratory of  Preventive Veterinary Medicine of  Ministry of  Agriculture , College of
Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100094 , China)
Abstract : A  63rd   chicken2embryo2adapted  duck  hepatitis  type   Ⅳvirus  vaccine  ( named  E63)  was ob2
tained t hrough serial passages of D HV in chick embryo s.   The  E63 was confirmed to  be  nonpat hogenic to
ducklings.   The immunizing do se was determined to  be at  2. 5 ×105. 12    ELD50 .  For t he immunized one2day2
old ducklings , serum neutralizing antibody titers  reach  t he peak and t he immunizatio n p rovided co mplete
p rotectio n against challenge wit h t he  homologous virulent  strain 7  days po stinoculation.   The  serum anti2
body titers could last for 4 weeks wit h a little bit  decrease.   The immunogenicity of  E63 was remained 3 -
6 mont hs when stored at   -  20 ℃.
Key  words : duck hepatitis type  Ⅳvirus ; vaccine
Corresponding author :  ZHAN G Da2bing
　　鴨病毒性肝炎是雛鴨的一種急性高度致死性疾
病 ,其發生和流行嚴重威脅著我國養鴨業的健康發
展。其病原是鴨肝炎病毒 ( duck  hepatitis  virus ,
D HV)  ,分為 3 個血清型 ,即 Ⅰ型、Ⅱ型和 Ⅲ型[ 1 ]   ,野
外還存在一類毒株 ,與 Ⅰ型僅有部分血清學相關性 ,
Sandhu 等(1992) 稱之為 Ⅰa 型[ 2 ]  。1984 年 ,郭玉璞
和潘文石確定我國存在 Ⅰ型[ 3 ]   ,20 世紀 80 -  90 年
代 ,我國學者成功研制出良好免疫原性的 Ⅰ型
D HV 雞胚化弱毒疫苗[ 4 -  6 ]   ,該苗的推廣使用一度有
效地控制我國 Ⅰ型鴨肝炎的流行。然而 ,近幾年來 ,
在我國許多地區 ,針對 Ⅰ型 D HV 所進行的主動免
疫或被動免疫并未能有效地控制鴨病毒性肝炎的暴
發。有學者認為我國出現了 Ⅲ型或某種新型[ 7 -  10 ]   ,
亦有學者分離到與 Ⅰ型存在明顯抗原差異的 D HV
毒株[ 11 -  12 ]  。筆者的數據顯示 , Ⅰ型仍是我國主要流
行的血清型 ,但在一些養鴨地區業已流行一種 Ⅰ型
的變異株 ,這類變異株與 Ⅰ型之間僅存在單向交叉
收稿日期:2006206207
作者簡介:鄭獻進(19792)  ,男 ,碩士 ,從事動物病毒學研究
通訊作者:張大丙 ,  E2mail :zdb @cau. edu. cn
中和作用 ,頗似 Sandhu 等(1992) 提出的 Ⅰa 型[ 2 ]   ,
但由于未能獲得 Ⅰa 型參考毒株 ,故暫將這類變異
株稱為 Ⅳ型[ 13 ]  。因此 ,進一步研制 Ⅳ型 D HV 疫苗
對于我國鴨病毒性肝炎的控制是非常必要的。
1 　材料與方法
1. 1 　實驗動物和雞胚 　1 日齡雛鴨和 9 日齡雞胚
分別購自中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所和中
國農業大學動物科技學院畜牧場。
1. 2 　毒株 　Ⅰ型 D HV 雞胚化弱毒疫苗株 C80 和
強毒株 C1 H 。Ⅳ型 D HV 毒株 E3 ,2001 年從河北
某鴨場分離 ,用雛鴨將 E3 返強 4 代后作為攻毒用
強毒 ,命名為 E3 H 。
1. 3 　Ⅳ型 D HV 雞胚化弱毒株的培育 　將 E3 接種
于 9 日齡雞胚尿囊腔 ,收獲 24h 后死亡雞胚尿囊液 ,
再接種于雞胚 ,連續傳代至 63 代 ,命名為 E63 。收
獲 24～48 h 死亡雞胚的胚胎、尿囊液和絨毛尿囊膜
制成勻漿 ,加慶大霉素抑菌 ,經無菌檢驗后作為疫
苗 , -  20 ℃保存。按常規方法測定其 ELD50  。
1. 4 　安全性檢測 　取 1 日齡雛鴨 30 只 ,分為 3 組 ,
每組 10 只。兩組分別經頸部皮下和腿肌接種未稀
6 中國獸醫雜志 2007 年(第 43 卷) 第12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Chinese Journal of  Veterinary Medicine 　　
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釋的疫苗毒1 mL/ 只 ,第 3 組為不接種對照組。1 周
后 ,對所有鴨只進行剖檢。
1. 5 　免疫劑量的測定 　用滅菌生理鹽水將 E63 分
別進行 10 倍、20 倍和 100 倍稀釋。取 1 日齡雛鴨
40 只 ,分為 4 組 ,每組 10 只。3 個組分別免疫上述
3 個稀釋度的疫苗 ,每只鴨均經頸部皮下接種 0. 5
mL ,每只鴨的免疫劑量分別為 5  ×105. 12  、2. 5  ×
105. 12 和 5 ×104. 12    ELD50   ,第 4 組為不免疫對照組。
于 7 日齡時經腿部肌肉注射強毒 E3 H ,0. 5 mL/ 只 ,
觀察 1 周。
1. 6 　中和抗體效價的測定 　取 1 日齡雛鴨 35 只 ,
分為 2 組。第 1 組 20 只按確定的免疫劑量經頸部
皮下接種疫苗 ,0. 5  mL/ 只;第 2 組 15 只為不免疫
對照組。在雛鴨 1 、2 、3 、4 周齡時分別采血分離血
清。用固定血清2稀釋病毒的方法進行雞胚中和試
驗 ,并計算中和指數。
1. 7 　疫苗的保存期測定 　用確定的免疫劑量免疫
1 日齡雛鴨 , 設不免疫對照組 , 7 日齡攻毒。檢測
-  20 ℃保存 3 個月和 6 個月的 E63 。
1. 8 　疫苗交叉保護試驗 　用滅菌生理鹽水將 Ⅰ型
疫苗 C80 和 Ⅳ型疫苗 E63 分別進行 20 倍稀釋。取
1 日齡雛鴨 60 只 ,分為 6 組 ,每組 10 只。第 1 組和
第 2 組免疫 E63 株 ,第 3 組和第 4 組免疫 C80 株 ,
均為頸部皮下接種 0. 5  mL/ 只 ,第 5 組和第 6 組為
非免疫對照組 ,隔離飼養。于 7 日齡時 ,第 1 、3 、5 組
接種 Ⅳ型強毒株 E3 H ,第 2 、4 、6 組接種 Ⅰ型強毒株
C1 H ,均為腿部肌肉注射 0. 5 mL/ 只。觀察 1 周。
1. 9 　抗血清交叉保護試驗 　按文獻[ 13 ]制備兔抗
C80 和 E63 的血清。取 1 日齡雛鴨 60 只 ,分為 6
組 ,每組 10 只。第 1 、2 組經頸部皮下注射兔抗 E63
株血清 ,第 3 、4 組以同樣的途徑注射兔抗 C80 株血
清 ,每只均接種 0. 5 mL ;第 5 、6 組為對照組 ,不注射
血清。24 h 后 ,第 1 、3 、5 組經腿部肌肉注射 Ⅳ型強
毒 E3 H ,第 2 、4 、6 組經腿部肌肉注射 Ⅰ型強毒株
C1 H ,0. 5 mL/ 只。飼養 1 周。
1. 10 　計算保護指數(p rotective index ,  PI)  　按公
式 PI = (對照組死亡率 -  免疫組死亡率) / 對照組死
亡率 ×100 。
2 　結果
2. 1 　Ⅳ型 D HV 雞胚化弱毒株 E63 的培育 　最初
幾代 ,雞胚在接種后 60  h 左右死亡 ,傳至 63 代 ,所
有接種雞胚均在 24 ～ 48  h  死亡 , 其 ELD50   為
10 -  6. 12 / 0. 1mL 。死亡雞胚的胚體表現為出血、水
腫、矮小化 ,部分雞胚肝臟有較明顯的壞死灶 ,有些
死亡雞胚的肝臟變綠。
2. 2 　E63 的安全性 　1 日齡雛鴨免疫疫苗原液后
無發病和死亡 ,剖檢未見肉眼可見的大體病變。
2. 3 　E63 的免疫劑量 　免疫 5 ×105. 12 個 ELD50 和
2. 5 ×105. 12 個 ELD50 的 E63 后 ,雛鴨可獲得完全保
護 ,而免疫5 ×104. 12 個 ELD50 的 E63 后 ,疫苗所產生
的保護指數有所下降 ,見表 1 。為了獲得 100 %的攻
毒保護 ,在隨后的試驗中 ,均以 2. 5 ×105. 12 個 ELD50
作為免疫劑量。
2. 4 　E63 的保存期 　-  20 ℃保存 3 個月 , E63 能完
全保護雛鴨抵抗同源強毒的攻擊;保存 6 個月 , E63
仍能給雛鴨提供有效的保護 ,但所產生的保護率和
PI 略有下降 ,見表 2 。
表 1 　疫苗株 E63 的免疫劑量
組別   免疫劑量( ELD50 / 只)   死亡數/ 攻毒數(只)      PI( %)
免疫組1 5. 0 ×105. 12
0/ 10
100
免疫組2 2. 5 ×105. 12
0/ 10
100
免疫組3 5. 0 ×104. 12
2/ 10
75
對照組 -
8/ 10
-
表 2 　疫苗株 E63 的保存期
組別     死亡數/ 攻毒數(只)        保護率( %) PI( %)
3 月 0/ 10
100
100
6 月 1/ 10
90
87. 5
對照組 8/ 10
-
-
2. 5 　中和抗體的產生 　雛鴨 1 日齡時免疫 E63 ,1
周齡、2 周齡、3 周齡和 4 周齡時的中和指數分別為
101. 90  、101. 7  、101. 51  、101. 15  。
2. 6  　Ⅰ型和 Ⅳ型弱毒疫苗的交叉保護 　Ⅰ型
D HV 雞胚化弱毒疫苗株 C80 和 Ⅳ型 D HV 雞胚化
弱毒疫苗株 E63 均能完全保護雛鴨抵抗同型強毒
的攻毒。但用異型強毒攻毒的結果表明 , Ⅰ型和 Ⅳ
型之間僅存在單向低度交叉保護 ,見表 3 。
表 3 　Ⅰ型和 Ⅳ型 D HV雞胚化弱毒疫苗的交叉保護試驗
疫苗株      血清型
攻毒毒株(血清型)
C1 H ( Ⅰ型)
E3 H ( Ⅳ型)
C80
Ⅰ型       0/ 10 (100)
4/ 10 (55. 6)
E63
Ⅳ型       5/ 10 (37. 5)
0/ 10 (100)
對照 8/ 10
9/ 10
　　結果指死亡數/ 攻毒數( PI %)
2. 7 　Ⅰ型和 Ⅳ型抗血清的交叉保護 　Ⅰ型和 Ⅳ型
抗血清均可完全保護雛鴨抵抗同型強毒的攻擊 ,但
針對異型強毒的攻毒只能產生單向低度交叉保護作
用 ,見表 4 。
表 4 　Ⅰ型和 Ⅳ型抗血清的交叉保護試驗
抗血清      血清型
攻毒毒株(血清型)
C1 H ( Ⅰ型)
E3 H ( Ⅳ型)
C80
Ⅰ型       0/ 10 (100)
4/ 10 (55. 6)
E63
Ⅳ型       6/ 10 (25)
0/ 10 (100)
對照組         -
8/ 10
9/ 10
　　結果指死亡數/ 攻毒數( PI %)
3 　討論
檢測結果表明 , Ⅳ型 D HV 毒株 E3 經過 9 日齡
雞胚傳代 63 代后 ,所獲得的雞胚適應毒株 E63 是
一株具有良好免疫原性的雞胚化弱毒疫苗株。該苗
對雛鴨安全無致病性 , 免疫劑量為 2. 5 ×105. 12  個
ELD50   ,保存期為 -  20 ℃,3～6 個月。雛鴨 1 日齡時
經頸部皮下注射雞胚化弱毒疫苗 E63 ,1 周齡時即
可產生高峰期的中和抗體 ,隨后抗體水平有所下降 ,
至 4 周齡時仍可檢測到一定水平的中和抗體。由于
鴨肝炎自然暴發時 ,多發生于 3 周齡內雛鴨 ,特別是
1～2 周齡的雛鴨 ,結合攻毒保護試驗和中和抗體的
監測結果 ,可認為給1日齡雛鴨免疫雞胚化弱毒疫
7
　　Chinese Journal of  Veterinary Medicine 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 中國獸醫雜志 2007 年(第 43 卷) 第 12 期
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內源性綿羊肺腺瘤病毒 NM 株 pol
基因的克隆與序列分析
王 　宇 , 劉淑英 , 韓 　敏 , 李建云
(內蒙古農業大學動物科學與醫學學院 , 內蒙古 呼和浩特 010018)
摘要: 參照 GenBank 中內源性綿羊肺腺瘤病毒 enJ S56A1 株 pol 基因序列設計了 2 對引物。應用 PCR 技術特異性地擴
增出病毒的 pol 基因片段 ,將其克隆到 PMD192T 載體后測序。應用計算機軟件將測定序列與內源性南非代表毒株 enJ S56A1
(A F153615) 的 pol 基因序列比較 ,核苷酸同源性為 99. 3 % ,推導出的氨基酸同源性為 95. 0 %。與外源性南非代表株J SRV2
SA (M80216) 的 pol 基因序列比較 ,核苷酸同源性為 99. 0 % ,氨基酸同源性為 99. 3 %。這也是我國首次報道的內源性綿羊肺
腺瘤病毒 pol 基因序列 ,為我國科研工作者進行更深入的研究奠定基礎。
關鍵詞: 內源性綿羊肺腺瘤病毒;  pol 基因; 克隆; 序列分析
中圖分類號:Q78 　　　　文獻標識碼:A 　　　　文章編號:052926005 (2007) 1220008202
Cloning and sequence analysis of  pol gene of  the  Inner Mongolia strain
of endogenous jaagsiekte sheep retrovirus
WAN G Yu , L IU  Shu2ying ,  HAN  Min , L I Jian2yun
(College of  Animal  Science and Animal Medicine ,  Inner Mongolia Agricultural University ,  Huhhot 010018 , China)
　　收稿日期:2006207212
基金項目:國家自然科學基金(30560108)
作者簡介:王宇(19812)  ,男 ,碩士 ,主要從事動物臨床內科學和動
物毒物檢驗學研究 , E2mail :hhhtwangyu @sina. com
通訊作者:劉淑英 , E2mail :liushuying_imau @126. com
苗 E63 ,能有效地保護雛鴨安全度過易感期。該疫
苗株與 Ⅰ型弱毒疫苗的抗體消長曲線基本一致[ 5 ]   ,
但總體上 E63 所產生的抗體水平要低。因此 ,還需
進一步提高其 ELD50 以獲得更高水平的中和抗體。
基于此 ,本試驗暫未進行 E63 的毒力返強試驗。
交叉保護試驗結果表明 , Ⅰ型和 Ⅳ型 D HV 的
雞胚化弱毒疫苗或高免血清均能有效地保護雛鴨抵
抗同型強毒的感染 ,但對異型強毒的攻毒缺乏足夠
的交叉保護。本實驗室于 2001 -  2005 年間從北京、
河北、山東、江蘇、內蒙古、重慶等地分離到 10 株
DHV ,血清型鑒定結果表明 ,來自內蒙和山東的 2 株
屬于Ⅰ型 ,來自河北、江蘇和重慶的 4 株屬于 Ⅳ型 ,而
北京地區的 4 株病毒中既包括Ⅰ型 ,也包括 Ⅳ型。結
合已有的研究成果[11 -  12 ]   ,可以認為 ,從上世紀末至
今 ,Ⅰ型D HV 在我國仍呈普遍流行的趨勢 ,但至少在
10 年前我國就已存在Ⅰ型 D HV 的抗原變異株 ,且變
異株業已廣泛流行于我國北京、河北、重慶、江蘇、福
建、廣東等地 ,因此 ,在這些地區 ,若僅針對Ⅰ型 D HV
進行被動免疫或主動免疫 ,免疫效果勢必表現為不確
實。結果提示 ,進一步研制Ⅰ型和 Ⅳ型二價疫苗對于
有效控制我國雛鴨病毒性肝炎的發生和流行是至關
重要的 ,而對于暴發鴨病毒性肝炎的鴨群 ,必需注射Ⅰ
型2 Ⅳ型二價抗體 ,方可獲得較好的治療效果。
參考文獻:
[ 1 ] 　Saif  Y M.  禽病學 [ M ] .  高福 ,蘇敬良 ,索勛 , 譯.  11 版.  北
京:中國農業出版社 ,2004 : 3762384.
[ 2 ] 　Sandhu  T S , Calnek B W , Zeman L .  Pat hologic and serologic
characterization of a variant of duck hepatitis type  Ⅰvirus[J ] .
Avian Dis , 1992 , 36 : 9322936.
[ 3 ] 　郭玉璞 , 潘文石.  北京鴨病毒性肝炎血清型的初步鑒定 [J ] .
中國獸醫雜志 , 1984 , 10 (11) : 223.
[ 4 ] 　潘文石 , 胡壽文 , 陳永南 , 等.  鴨肝炎病毒的研究( Ⅱ)  —鴨肝
炎病毒的雞胚化弱毒株(D HV241) [J ] .  北京大學學報:自然科
學版 , 1980 , 4 : 83291.
[ 5 ] 　張衛紅.  雛鴨病毒性肝炎弱毒疫苗的研究 [ D ] .  北京: 中國農
業大學 , 1989.
[ 6 ] 　徐克勤 , 郭美玲 , 吳連根 , 等.  鴨肝炎病毒弱毒株的研究[J ] .
中國獸醫雜志 , 1990 , 16 (1) : 47249.
[ 7 ] 　程安春 , 汪銘書 , 陳孝躍 , 等.  發現于我國的 Ⅲ型雛鴨肝炎病
毒的分離、鑒定及其特性研究[ C]/ / 中國畜牧獸醫學會禽病學
分會第十一次學術研討會論文集.  成都:  中國畜牧獸醫學會
禽病學分會 , 2002 : 620.
[ 8 ] 　蘇敬良 , 黃瑜 , 賀榮蓮 , 等.  新型鴨肝炎病毒的分離及初步鑒
定[J ] .  中國獸醫科技 , 2002 , 32 (1) : 15216.
[ 9 ] 　許力干 , 趙武 , 陳澤祥 , 等.  廣西部分地區鴨肝炎流行及防治
現狀調查[J ] .  廣西農業科學 , 2002 , 3 : 142.
[ 10 ]  黃安國 , 蔣玉雯 , 白安斌 , 等.  新型鴨肝炎病毒的分離與初步
鑒定[J ] .  廣西畜牧獸醫 , 2003 ,  (5) : 1982199.
[ 11 ]  林世棠 , 黃瑜 , 黃紀銓 , 等.  一種新的鴨傳染病研究:1.  流行
情況與初步診斷[J ] .  中國預防獸醫學報 , 1996 ,  (4) : 14217.
[ 12 ]  陳建紅 , 張濟培 , 司興奎 , 等.  標準鴨肝炎 Ⅰ型血清對鴨肝炎
野毒株的免疫保護試驗[ J ] .  中國獸醫學報 ,  2001 ,  21 ( 3) :
2312234.
[ 13 ]  鄭獻進 , 張大丙 , 曲豐發 , 等.   Ⅰ型鴨肝炎病毒變異株的鑒定
[J ] .  中國獸醫雜志 , 2006 , 42 (5) : 15216.
8 中國獸醫雜志 2007 年(第 43 卷) 第12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Chinese Journal of  Veterinary Medicine 　　
© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net

haiwuya

四型鴨肝炎？暫時還沒聽說過