養殖前沿 | 酒石酸泰萬菌素抑制高致病性PRRSV在體外的復制

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養豬職業經理人，微信ID：YZZYJLR2016  

導讀

　　豬繁殖與呼吸綜合征（PPR）是豬的一種傳染性疾病，可造成母豬的生殖障礙及年幼豬的呼吸紊亂，該病是一種全球范圍內具有重要經濟意義的豬病。這種疾病以造成各階段豬41℃以上高溫、厭食、耳部（藍耳）和身體變紅及高死亡率為主要特征。現有疫苗僅能提供針對HP-PRRSV毒株的部分保護力。近年來有報道稱大環內酯類抗生素具有抗PRRSV的抗病毒效果，因此疫苗及藥物的聯合使用可能會更有效地預防PRRS。

　　本研究對大環內酯類抗生素--酒石酸泰萬菌素（乙酰異戊酰泰樂菌素）抑制HP-PRRSV體外復制及誘導生產的細胞線粒體超氧化物的抗病毒活力進行了測定。

1.材料和方法

　　將各種濃度（0.1、1、10及100 μg/ml）的酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素（API of Aivlosin®, Ecopharma Inc.）加入至MARC145細胞，于37℃作用4小時后，用PBS洗滌5次。

　　在間接免疫熒光試驗（IFA）中，將HP-PRRSV 越南分離株100186-614接種至細胞后培養24至48小時，病毒的接種濃度為102及103 TCID50/ml。使用80%的丙酮固定細胞，使用感染100186-614的豬血清及FITC標記的抗豬IgG進行IFA檢測，使用熒光顯微鏡進行熒光觀察。

　　在流式細胞檢測（FCM）中，使用酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理細胞，接種5x10~5 TCID50/ml 100186-614分離毒株后培養48小時。使用4%的多聚甲醛固定細胞后，0.5%皂苷進行細胞的透化，采用IFA類似方法法進行細胞染色。

　　通過EPICS XL ADC及XPO32軟件對10000個細胞中的陽性細胞計數，從而計算得出總的HP-PRRSV抗原陽性細胞數。檢測細胞中線粒體超氧化物時，使用100 μg/ml的酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理細胞后，加入5 μM 的MitoSOX (Molecular Probes, Invitrogen,Eugene, OR, USA)，37℃作用30分鐘，用含鈣、鎂離子的Hank’s溶液洗滌2次，4%多聚甲醛固定細胞。

　　使用488nm FCM激光激活MitSOX，測定并收集FCM 575nm（FL2）數據，以檢測細胞中的細胞中線粒體超氧化物。數據以MitoSOX熒光平均亮度直方圖的方式呈現。

2.結果

　　結果表明：細胞經濃度為100μg/ml的酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理后，在IFA檢測時表達HP-PRRSV抗原的細胞數量減少。然而，使用其余濃度進行細胞處理時，呈病毒陽性的細胞數并未減少，其結果與對照相同。

　　在FCM檢測中，當使用100 μg/ml濃度處理細胞時，HP-PRRSV的復制減少將近20%（表1）。經其他濃度酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素病毒處理后的陽性細胞比例與對照組差異不顯著。在檢測細胞中線粒體超氧化物時，FCM直方圖表明，100μg/ml酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理4小時后，MitoSOX熒光強度減少2.1± 0.3倍。

表1 FCM檢測時HP-PRRSV陽性細胞比例

	酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素
	未處理	100 μg/ml	10 μg/ml
第一次檢測	51.64%	39.86%	43.62%
第二次檢測	38.82%	28.08%	43.02%

3.結論與討論

　　本研究中，經酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理后表達HP-PRRSV抗原的細胞數量減少。結果證實，酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素具有抑制HP-PRRSV體外復制的抗病毒活性。這種抗病毒活性與細胞中線粒體超氧化物的增加有關。還需對酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素的抗病毒機制進行闡明并對其在體內的效果進行進一步鑒定。

（資料來源于世界豬病大會論文集，邱文英  譯）